Kuinka käyttää GSH Tasot havaitsemisessa ROS

glutationin tai GSH, on kuin keskeisiä tripeptidi valmistettu kysteiini, glutamaatti ja glysiini. Se on voimakas antioksidantti, joka suojaa solujen ja elinten kehon haitallisilta vaikutuksilta ROS, tai reaktiivisia happiradikaaleja, jotka on muodostettu molekulaarisen hapen seurauksena eri aineenvaihduntaan kehossa. Antioksidantit, kuten glutationi, neutraloidaan ROS ja estää heitä vuorovaikutuksessa ja vahingoittaa DNA: ta ja proteiinia soluja. Suhde hapettuneen ja pelkistetyn muodossa GSH elimistössä on osoitus ROS-aiheuttamaa oksidatiivista stressiä elimistössä. Asiat Tarvitset
Ruisku
perhosneulan
Centrifuge
Natriumhepariini
Pakastin
sulfosalisyylihapolla
GSH Reaktioaine
Microplate
Valonlähde
GSH standardiliuosta
Näytä lisää Ohjeet
1

Piirrä noin 2 ml verta laskimopunktoinnilla ja anticubetal suoni 23-mittari perhosneulan kiinnitetty 5 ml. Lisää näyte testataan putkiin, jotka sisältävät natriumia hepariinia ja varovasti kääntää putken sekoittamista.
2

Kerää punasoluja sentrifugoimalla näytettä 2500 kierrosta minuutissa viiden minuutin ajan. Jäätyä ja sulaa näyte kolme kertaa rikkoa soluja. Sentrifugoidaan solulysaatti liuoksessa 10 minuutin ajan 12000 rpm ja 4 astetta, ja supernatantti otetaan talteen.
3

Poista proteiinia näytteestä lisäämällä 5 prosenttia sulfosalisyylihapolla ja sentrifugoimalla näytettä 12000 rpm viisi minuuttia 4 ° C asteessa. Säilytä deproteinoidut Supernatantti -112 astetta.
4

Sekoita tioli havaitseminen agentti, GSH-reduktaasi, nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatti ja koepuskuriin mittasuhteissa merkitty kitin valmistaja tehdä GSH reaktioseokseen. Kunkin kemiallisten riippuu testien määrää aiot suorittaa. Laimenna GSH reaktioseokseen 5 prosenttia sulfosalisyylihapolla saada pitoisuudet 16, 32, 63, 125, 250 ja 500 mikrolitraa.
5

Lisää 1-10 mikrolitraa deproteinoidut verinäytteen kuoppiin mikrolevyn. Lisää laimennettiin GSH vakio ratkaisu, joka on saatavilla testaus kit, kuhunkin kuoppaan, jotta kokonaismäärä kuhunkin kuoppaan 10 ui.
6

Lisää 90 mikrolitraa GSH reaktioseoksen että teit Vaiheessa 4 kunkin hyvin mikrolevylle. Sekoita reagenssi ravistamalla levyä 30 sekuntia.
7

Mitataan heti asettamalla levyä valoa aallonpituuksilla 405 ja 415 nanometriä. Inkuboi levyä 30 minuuttia. Ota absorbanssilukemia välein viiden minuutin aikana itämisaika.
8

Laimennetaan 6 millimoolin käsitelty näyte 5 prosenttia sulfosalisyylihapolla ja trifluromethane naatti ratkaisu. Tämä poistaa kaikki alennettua GSH liuoksesta. Lisää 1-10 micoliters tätä liuosta kuoppiin mikrolevyllä ja toista vaiheet 5, 6 ja 7. Tämä auttaa arvioimaan määrää hapettuneen GSH näytteessä.
9

Tontti absorbanssi ja näytteen pitoisuudet kuvaajan saada GSH käyrä sekä vähentää ja hapettuneen glutationin. Laske suhde molempien muotojen GSH. Lisääntyvät oksidatiivisen GSH tasoilla osoittavat oksidatiivista stressiä ja ROS.