Miten mitata NADH

NAD ja NADH ovat pyridiini nukleotidin mukana aineenvaihduntaa. NADH ja NAD yhteistyö-entsyymejä löytyy mitokondrioita, voimatekijöistä solun. Sekä NAD ja NADH ovat mukana solureaktioissa kuten hengitys ja fotosynteesi, jossa energiaa ja vetyä syntyy. NAD ja NADH polttoaineen biokemiallisia reaktioita, jotka vaativat useita entsyymejä tuottaa ATP, pääasiallinen energialähde soluissa. Asiat Tarvitset
solut tai kudos tutkitaan
NADH iinianalyysikitissä
fosfaattipuskuroitua suolaliuosta
Dry Ice
Lämmitys lohko
96 kuoppalevy
Centrifuge
Labeled putket
levynlukijaa
Vortex
tunnettu pitoisuus NADH
Näytä lisää Ohjeet
Pitoisuus
1

Pese solujen tai kudosten tutkitaan kylmällä fosfaattia -puskuroitu suolaliuos, PBS. Ote soluja tai hajottaa kudoksen uuttopuskuriin sijoittamalla seos kuivan jään päällä 20 minuuttia ja sitten huoneen lämpötilassa 10 minuuttia. Toista.
2

Vortex 10 sekunnin ajan. Spin sentrifugissa 5 minuutin pelletti solu-tai kudos roskia. Poista supernatantti, nestemäisenä, ja aseta nestettä puhtaaseen putkeen.
3

Filter kelluva kautta erikoistunut suodatin poistaa entsyymejä, jotka erittely NADH.
4

Poista 200 mikro litraa, paikka puhtaaseen putkeen ja lämpöä 60 astetta kuumentimella 30 minuuttia denaturointivelvollisuutta NAD. Jäähdytä ja sentrifugoidaan ja poistaa nestemäisenä. Siirtää 50 mikro litraa 96-kuoppaisen levyn, jokainen näyte on kahtena tai kolmena kappaleena. Kokonaismäärän määrittämiseksi NAD, NADt, ei lämmitä.
5

Valmista ja lisätä pyöräilyä sekoitetaan 96-kuoppaisen levyn. Sekoitetaan ja inkuboidaan 5 minuuttia. Lisää 10 mikro-litraa kehittäjä ja annetaan inkuboitua huoneen lämpötilassa jopa 4 tuntia. Lisää luukun ratkaisun. Lue värimuutoksen levylukijalla tai fluorimetriä riippuen pakki.
Standardikäyrän ja laskeminen
6

Valmista standardikäyrään ottamalla tunnettu pitoisuus NADH ja laimentamalla se uuttopuskuriin. Laimennetaan eri pitoisuuksia, varmistetaan pää tilavuus on sama kuin näytteet. Levy samalla 96-kuoppaisen levyn kuin näytteet. Lue optinen tiheys.
7

Piirrä standardikäyrään kuvaajan keskittyminen X-akselin ja optisen tiheyden Y-akselin. Ota keskimäärin kunkin näytteen ja lukea keskittymistä standardikäyrästä kuvaaja.
8

Laske NAD /NADH suhde vähentämällä yhteensä NAD, NADt, NADH: lta ja sitten jakamalla NADH.