Kylmäsäilytys Menettelyt

kylmäsäilytys menettelyt ovat ne, jotka mahdollistavat solujen säilyttää loputtomiin käyttämällä erittäin kylmän keskeyttää aineenvaihdunnan toimintaa. On olemassa kaksi päätyyppiä kylmäsäilytys menettelyjä: tasapaino (tavanomaisia ​​hitaasti jäädyttäminen) ja ei-tasapaino tai erittäin nopea jäädyttäminen (lasituksen). Termi lasituksen tulee latinan "lasimainen" tai lasimainen. Molemmat menettelyt käyttää cryoprotectants pakkasnestettä-tyypin ominaisuudet estää soluvaurioita aikana jäätyminen. Kun solua jäädytetään tai lasitetut, ne voidaan säilyttää loputtomiin upottamalla ne nestemäistä typpeä, erittäin kylmää nestettä, jonka lämpötila on -196 C (-321 F). Palauttamiseksi aineenvaihdunnan aktiivisuutta solussa sulattamisen jälkeen myrkyllisiä kryoprotektantteja on poistettava solu ja normaali veden tasapaino vähitellen palautuu kuin solu palautetaan normaaliin toimintaan lämpötilassa. Yhteenveto
yleiskatsaus

kylmäsäilytys menettelyt ovat ne, jotka mahdollistavat solujen säilyttää loputtomiin käyttämällä erittäin kylmän keskeyttää aineenvaihdunnan toimintaa. On olemassa kaksi päätyyppiä kylmäsäilytys menettelyjä: tasapaino (tavanomaisia ​​hitaasti jäädyttäminen) ja ei-tasapaino tai erittäin nopea jäädyttäminen (lasituksen). Termi lasituksen tulee latinan "lasimainen" tai lasimainen. Molemmat menettelyt käyttää cryoprotectants pakkasnestettä-tyypin ominaisuudet estää soluvaurioita aikana jäätyminen. Kun solua jäädytetään tai lasitetut, ne voidaan säilyttää loputtomiin upottamalla ne nestemäistä typpeä, erittäin kylmää nestettä, jonka lämpötila on -196 C (-321 F). Palauttamiseksi aineenvaihdunnan aktiivisuutta solussa sulattamisen jälkeen myrkyllisiä kryoprotektantteja on poistettava solu ja normaali veden tasapaino vähitellen palautuu kuin solu palautetaan normaaliin toimintaan lämpötilassa.
Cell- Erityiset tekijät

menettelyä käytetään kylmäsäilöä solujen tai kudoksen, riippuu useista tekijöistä, mukaan lukien koko solun, määrä solu-nesteen (solulimassa) ja monimutkaisuus solun (yksittäinen solu tai kudosta). Solut, joissa on suuri määrä sytoplasmassa, kuten munat on vaikeampi kylmäsäilöä kuin solut vain jäljellä sytoplasmassa, kuten siittiöitä. Kylmäsäilytys munasarjakudoksen on haastavaa, koska ainakin kolmea eri solutyyppejä erikokoista ovat läsnä munasarjakudoksen, kukin eri optimaalinen jäädyttämistä tarpeisiin. Slow-jäädyttämistä protokollia on käytetty menestyksekkäästi eri tyyppisiä soluja. Lasituksen hetkellä on tehokkainta yksisoluiset jäädyttämistä ja yhtä tehokas kudoksia, mutta tutkimukset jatkuvat optimoida lasituksen kudosten.
Rooli cryoprotectants

solulima solu sisältää vettä, joka muuttuu jääksi kiteitä pakkasella. Kun jäätä sisällä solu, solu on murskataan ja kuolee. Siksi, neste solussa on poistettava ennen kuin se menee pakkasessa välttämiseksi soluvaurioita. Erilaisia ​​pakkasnestettä (kylmältä suojaavan) nesteitä voidaan kuivata solun ennen pakastusta, mukaan lukien glyseroli, propaanidioli, dimetyyli sulfoxde (DMSO), etanolia ja sokerit, kuten sakkaroosi ja trehaloosi. Optimaalinen määrä jäähdytyksen (ja sulatus) riippuu kylmältä suojaavan aineen käytetty ja ominaisuus solun tai kudoksen olla (tai että oli) jäädytetty. Cryoprotectants ovat myrkyllisiä hajottavien solujen niin solun vastuita cryoprotectants lämpimämmässä metabolinen lämpötila on minimoida tai välttää. Sulatuksen tai lämmityksen solujen kylmäsuojausai on poistettava kokonaan solusta ennen aineenvaihdunta on palautettu.
Equilibrium Versus ei-tasapaino kylmäsäilytys Menettely

määrä jäädyttämistä riippuu siitä, onko jäädyttäminen protokolla on tasapaino-tai ei-equilbrium-pohjainen. Tasapainon menettelyillä, optimaalinen Jäätymisnopeus on saavutettu, kun on olemassa tasapaino nopeuden, jolla solu on kuivattu vettä ja nopeus, jolla vesi solun ulkopuolella on muuttanut jään vaiheessa. Nämä tasapainoa tai hitaasti jäädyttämismenetelmillä yleensä kestää tunteja ja tietokonetta käytetään ajaa ohjelmoitava korko pakastin varmistaa, että jäädyttäminen hinnat ovat täsmälleen tarpeen mukaan. On tyypillisesti "hold" askel protokollan lähellä alkua, jotta manuaalinen luominen käynnistin jäistä tai "kylvö" nesteessä solujen ulkopuolella.

Lasituksen täysin erilaisen lähestymistavan jäädyttäminen, joka ei perustu rampit ja saavuttaa tasapaino kuivumista ja jääkiteiden muodostumista käytetään. Vitrifikaatio on niin erittäin nopeaa, että ei ole riittävästi aikaa jään muodostumista ja solujen neste muunnetaan suoraan lasiaiseen tai lasi-faasi, vahingoittamatta soluun. Ohjelmoitava korko pakastimet ei tarvita, koska solu suoraan ajautunut erittäin kylmä nestemäistä typpeä, saavuttaa hetkellinen lasitilaan.
Slow-Freeze Menettely

ensimmäinen vaihe hidas-freeze menettely on altistaa solun kylmältä suojaavan asteittain portaittain hitaasti saavutettu tasapainotila kennon jäätymisen estoaineen kanssa samalla vapauttaen vettä. Kun solut on poistettu suurin osa solun vettä, solut kylmältä suojaavan neste on sijoitettu astiaan jonkinlaista, kuten muovi olki, lasiampulliin tai muovista vial.The määrä nestettä ympäröivä soluja hidas jäädytys on tyypillisesti vähemmän kuin tl, ja se voi olla vain muutama tippa. Pre-leimattu säiliö on täytetty, suljetaan ja laittaa ohjelmoitava pakastin, joka hitaasti lämpötila laskee kontin ajan minuutin tai tunnin hyvin alhaisissa lämpötiloissa. Muutaman minuutin jäähdytyksen, käynnistin jääkiteitä on muodostettu säiliön sisällä, jonka "kylväminen" säiliöön. Ymppääminen suoritetaan käyttämällä työkalua (esimerkiksi pihdit), joka on ennalta jäähdytetty nestemäisessä typessä koskettaa säiliön ja aiheuttavat jääkiteiden muodostumista. Tämä käynnistin kristalli aloittaa hallitusti jääkiteiden muodostumista yhdellä paikalla, turvallisesti pois soluista. Kun kylvö on suoritettu, loput jäähdytyksen ramppien voi edetä. Kun säiliö saavuttaa lämpötila välillä -30 ja -85 C: ssa, sisältävän säiliön solut voidaan ajautunut suoraan nestemäistä typpeä loppuun jäähdytys -196 C.
Vitrifikaatio

Ultra-nopea epätasapainossa jäähdytys menettelyjä kuten lasituksen käyttää suurempia pitoisuuksia cryoprotectants yhdistettynä lähes hetkellinen jäätymisnopeudella saavuttaa syöksyä solut suoraan nestemäistä typpeä. Vitrifikaatio ohittaa jääkiteiden muodostumisen vaihe ja siirtää vettä suoraan lasin kaltainen vaihe. Vitrifikaatio saavutetaan sama päätepiste kuin hidas jäädyttämistä, mutta nopeudella -3000C/min verrattuna 10C/min tai enemmän. Ja lasituksen solut sijoitetaan yleensä kärki olki ja ylimääräinen kylmältä suojaavaa on poistettu, jättäen vain sen verran, että solu tarttuu säiliöön pintajännitys, ennen syöksyä nestemäisessä typessä. Koska jäädyttäminen on niin nopeaa, kesto altistumisen cryoprotectants on paljon vähemmän, ja paljon korkeampia pitoisuuksia cryoprotectants voidaan sietää solu. Lämpeneminen solu palauttaa sen normaaliin aineenvaihdunnan toimintaa on myös uskomattoman nopea. Käsittely lasitetun näytteitä on paljon vaativampi kuin hitaasti pakastettuja näytteitä koska jopa lyhytaikainen altistuminen lämpötilaa korkeampi kuin nestemäistä typpeä voi aloittaa suunnittelematon lämpeneminen prosessi ja uudelleenjäädyttämistä, mikä heikentää solun.