Molekyylikloonaus pöytäkirjat

Molekyylikloonaus pöytäkirjat kattavat menettelyt, joilla määritellään, eristämiseen ja monistamiseen DNA-sekvenssi. Perinteiset rajoitus-ja ligaatio kloonaus protokollia aloittaa DNA: n fragmentoitumista, joilla on rajoitettu endonukleaaseilla (entsyymejä, jotka leikkaavat DNA-säikeet restriktiokohtiin), DNA fragmenttiinsidonnan (korjaus katkoksia DNA-molekyylejä), transfektio (käyttöönotto nukleiinihapon soluun elin) ja valinta (valitsemansa yksittäisten genomien replikointi). Eristäminen

protokollat ​​eristämiseen DNA-fragmentti, ensimmäinen vaihe molekyyli-kloonaus, sisällytetään usein polymeraasiketjureaktio (PMR), joka käyttää sykliä lämmityksen ja jäähdytyksen monistamaan paloja DNA: ta. Saavuttaa tavoite järjestyksessä, muu protokollia ovat DNA ultraäänellä, reaktio entsyymidigestio ja Kemiallisesti syntetisoitujen oligonukleotidien. Nämä protokollat ​​vaihdella suuruus ja määrä eristettyä DNA tarvitaan.
Sitomiseen

protokollat ​​sitomiseen joissa käytetään entsyymiä, DNA-ligaasilla, liittyä DNA-molekyylejä yhdessä kovalenttinen sidos. Pöytäkirja sanelee DNA-fragmentteja yhdistelemällä, kloonausvektori, ligaatiopuskuriin, DNA ligaasi ja steriloitu vesi mikrosentrifugiputkeen ja inkuboimalla yön yli 4 astetta.
Transfection

pöytäkirjat transfektioon tai infuusio DNA soluun käyttäen ei-virus välineet, usein liittyy suonensisäisten DNA suoraan sytoplasmassa. Muut menetelmät ovat käytetään kemiallisia reagensseja, kuten kalsium-fosfaatti-ja lipidejä, toimittaa transfektion monimutkainen solukalvon läpi. Tämä menetelmä testaa vaikutuksia geenimodifikaatiomenetelmiä toimintaan erityisiä geenejä.
Selection

valinta, tai seulonta, protokollia mitkä solut onnistuneesti järjestetään DNA-insertin ja osoittavat jonka solut tarvitsevat eristäminen. Sentrifugin satoja soluja, jotka sisältävät transfektoituja DNA: ta, jotka sitten inkuboitiin lysotsyymin (luonnossa esiintyvä entsyymi) puskuria ja käsiteltiin emäksinen pesuaine, jossa proteiinit ja kalvot liukoisuutta. Käyttämällä asetaatti saostaa proteiinit, sentrifugoidaan ja juustokangasker suodatin DNA sisältävä supernatantti (liukeneva neste jäljellä sentrifugoidun yhdiste). Supernatantti saostetaan polyetyleeniglykoli, sentrifugoitiin ja suspendoitiin cesiumkloridi ja etidiumbromidia puskuria. Etidiumbromidia värjää DNA tiheyden mukaan, ja käyttämällä pitkän aallon UV-valon, alemman kaistan DNA uutetaan viisi cc ruisku. Tasapainotettu ioninvaihtokolonniin erottaa DNA etidiumbromidia ja cesium-kloridi, ja lopullinen DNA-pelletti suspendoidaan puskuriliuokseen ja havaita agaroosigeelielektroforeesilla.